脊髓性肌（jī）萎缩症（spinalmuscularatrophy，SMA）是一种常染色体隐性遗传病，居儿童致死性常染色体隐性遗传病（bìng）的第2位。位（wèi）于（yú）染色（sè）体（tǐ）5q11.2～q13.3上的运动（dòng）神（shén）经元存活基因（Survivalmotorneuron，SMN）是SMA的主（zhǔ）要致病基因。

　　人基因组有两（liǎng）个紧邻的高度同源的SMN基（jī）因：端粒侧的SMN1和着丝粒侧的SMN2，两者仅（jǐn）有（yǒu）5个碱基不同。SMN1是主要功能基因，该基因突（tū）变可导致SMA发病，SMN2为临床表型的调节（jiē）基因，影响病情的严重程度，其拷贝数增（zēng）加（jiā）可减（jiǎn）轻SMA表型。目前（qián）已知约（yuē）94％的SMA患者为SMN1基因第7和（或）第8外显子纯（chún）合缺（quē）失所致，少数病例（lì）可（kě）由SMN1基因点突（tū）变或小的（de）缺（quē）失（shī）引起。

　　SMN1基因外显（xiǎn）子缺失检测的意义

　　SMA在人群中的发病率为（wéi）1/5000～1/10000，群体携带者频率为1/35～1/50，是出生缺陷的高危因素，因此极有必要进行SMA携带（dài）者的人群筛查，并通过产前（qián）诊断技术降（jiàng）低人群中SMA患（huàn）儿的出生率。

　　临床（chuáng）上将SMA分为Ⅰ、Ⅱ和（hé）Ⅲ型，即婴儿型、中间（jiān）型和少（shǎo）年型，严重程度依次递减。神经专（zhuān）科医生一（yī）般根据患者（zhě）发病年龄、临床（chuáng）表现及病情（qíng）进展程度进行临床诊断，辅助（zhù）检查方法包括肌电图、肌酶和肌肉（ròu）活检，结合（hé）家族史（shǐ）和SMN1基因分析可进行确诊。由于SMA患儿中约94%为SMN1基因外（wài）显（xiǎn）子纯合缺失，因此，SMN1基因缺失检测对于（yú）SMA的（de）诊（zhěn）断具有更高的灵敏度和特异（yì）性。且对不同型的SMA患者，SMN1纯合缺失率没有显著差异，所以，SMN1纯合缺失的检测对于不同型SMA患者具有相同（tóng）的临床诊断价（jià）值。在欧美人群中，SMN1基因纯合（hé）缺失检测已成（chéng）为诊断（duàn）和排除诊（zhěn）断SMA的（de）首选方法。

　　SMN1基（jī）因缺失检测试剂的（de）现状

　　目（mù）前（qián），SMN1基因（yīn）外显子缺失检（jiǎn）测试剂较为缺乏，临床（chuáng）检验实验室较为公认的方法是PCR结合限制性（xìng）片（piàn）段长度多态性（xìng）（PCR-RFLP）的（de）方法（fǎ）。但（dàn）该方法（fǎ）操（cāo）作较为繁琐，且重（chóng）复（fù）性差，不利于标准化，不易推广。同时，这种方法只能检测（cè）出纯（chún）合缺（quē）失，无法确认杂合（hé）缺失。

　　荷兰的SMAMLPA检测试剂可对待（dài）测靶序列进行半定量（liàng）分（fèn）析，因此既可检测纯合缺失，亦可确认（rèn）杂合（hé）缺失。在国内（nèi）外（wài）已有多篇文献（xiàn）报（bào）道采用该方法进行SMA患者诊（zhěn）断和SMA携（xié）带者筛查（chá）。但该（gāi）产品目前（qián）仍为“仅用于研究”的试剂，尚未按照体外诊（zhěn）断（duàn）类医疗器（qì）械上市（98/79/EC）。

　　2015年底，原（yuán）国家食品药品（pǐn）监管总局批准了（le）第一项（xiàng）SMN1缺失突变检测（cè）试（shì）剂上市。该产品采用多重实时（shí）荧光MGB-TaqMan探针PCR法，以人（rén）基因组（zǔ）单拷贝基因RPP40为（wéi）内（nèi）参基因，对SMN1基因第7外显（xiǎn）子和（hé）第8外显子拷贝数（shù）进行相对定量检测，用于SMA患者的体外辅（fǔ）助分子诊断。SMN1基因外显子缺失检测的（de）难点之一在于排除高同源（yuán）性基（jī）因SMN2的干扰，特别是对于SMN2高拷（kǎo）贝数（shù）的受试者，需（xū）保证结果的准确可靠。该产品通过（guò）对（duì）实时荧光PCR相对定量（liàng）、绝（jué）对定量技术进（jìn）行系（xì）统整合，并（bìng）在反应体系中加入（rù）特定（dìng）化（huà）学组分，以抑（yì）制（zhì）PCR引物（wù）3’端的（de）胞嘧啶（C）与胸（xiōng）腺嘧（mì）啶（dìng）（T）的错配，增（zēng）加（jiā）PCR扩增的（de）特异性，从而有效控制SMN2基因非特（tè）异性扩（kuò）增对检测结果的影响（xiǎng），准确检出高拷（kǎo）贝数（shù）SMN2样本中SMN1基因第7和第8外显子的缺失情况（kuàng）。

　　鉴于国（guó）内外（wài）尚无任何按照体外诊断（duàn）试剂批准上市的（de）SMA分子诊（zhěn）断（duàn）产品，因此临床试验方案中依（yī）据（jù）EMQN关（guān）于《SMA分子（zǐ）诊断最佳实（shí）践指南（nán）》，采用（yòng）了（le）国内外SMA体外（wài）辅（fǔ）助分（fèn）子诊断（duàn）领域公认的PCR-RFLP法作为对照方法。临床试验共完成1069例，其中正常对照组777例，SMA病（bìng）例（lì）组292例，统计（jì）分析结（jié）果（guǒ）显（xiǎn）示（shì）申报产品（pǐn）与对比（bǐ）方法检测结果的一致性（xìng）为（wéi）100%（95%置信区间：99.66%～100%）。此外，9747例正常成年人大样本中目标外显子△△Ct分（fèn）布范围的调查亦（yì）显示，该产（chǎn）品的纯（chún）合突变判（pàn）断界（jiè）值设置合理。

　　该试剂目（mù）前批准的预期用途仅包含纯合缺失的检测，尚不能用于杂合（hé）缺（quē）失的检（jiǎn）测，因此（cǐ）无法用（yòng）于SMA携带者的筛查，这是该产品（pǐn）的缺陷之一（yī）。

　　事（shì）实上（shàng），该产品在设计上已考虑到SMA携带者的检测，其检测（cè）原（yuán）理是以待（dài）测样本中目（mù）标外显（xiǎn）子（zǐ）荧光（guāng）信号Ct值与内参基（jī）因荧（yíng）光（guāng）信（xìn）号Ct值之（zhī）差（chà）（△Ct_s），与正常对照品三个梯（tī）度稀释（shì）品中目标外显（xiǎn）子荧光信号Ct值（zhí）和（hé）内参基因荧光信号Ct值之差的平均（jun1）值（△Ct_a）之（zhī）差，即△△Ct，作为（wéi）待测样本中（zhōng）目标外显子拷贝数（shù）检测变量（liàng）（△△Ct=△Ct_s-△Ct_a）。根据实时荧光（guāng）定量PCR相（xiàng）对（duì）定量的基本数学原理推导得到申报产品检测变量（liàng）△△Ct的计算公（gōng）式，依据这一计算公式（shì）可推导出纯合缺（quē）失、杂合缺失和（hé）野生（shēng）型的△△Ct理论值（或范围）；再结合目标外显（xiǎn）子与（yǔ）内（nèi）参（cān）基因扩增效率差异以及SMN2不同拷贝数的影（yǐng）响，可对上述△△Ct理论值进行优化。结果显示纯（chún）合缺失、杂合缺失和野生（shēng）型的△△Ct值（或范围）之间可设（shè）置合理的（de）判断界值，因此理论上该产（chǎn）品可分别检测出三种基因状（zhuàng）态。但鉴于生产企业（yè）对杂合缺失（shī）与野生型之间的判断（duàn）界（jiè）值研（yán）究（jiū）尚不透（tòu）彻，再加上缺乏（fá）可判（pàn）定杂合缺失的（de）对比方法（fǎ）等（děng）其（qí）他困难，本次注册申请的预期（qī）用途（tú）仅限于检测纯合突变，即SMA患者辅助诊断。

　　综上，SMN1基因外显子缺失检（jiǎn）测在SMA疾病诊（zhěn）断和SMA携带者筛查中具有重要的临（lín）床价值。然而到目前为止，受到技（jì）术（shù）水平的限制，相关的体外诊断试剂比较缺乏（fá），特（tè）别（bié）是可用于SMA携带（dài）者（zhě）筛查的杂合缺（quē）失检测，尚（shàng）无（wú）适合的体外（wài）诊断试（shì）剂（jì）上市。（器（qì）审中心审评六部  何（hé）静云）

来源：中国医药报